A)

Colete uma amostra representativa de insetos em campo. O material coletado pode consistir em lagartas já em estágio adequado para testes imediatos, ovos ou larvas de primeiro ínstar (L1) para criação até o estágio desejado, ou ainda indivíduos destinados à formação de uma população F1 para posterior avaliação. Os insetos devem ser mantidos em condições adequadas, evitando estresse por temperatura, umidade inadequada ou falta de alimento.

B)

Recolha uma quantidade suficiente de folhas da planta hospedeira que não estejam infestadas e não tenham recebido tratamento. As folhas inteiras são preferíveis ou, para algumas culturas, as porções distais. Após a coleta, evite o murchamento do material vegetal, mantendo-o em condições úmidas, por exemplo, em sacos plásticos. As espécies de Brassica oleracea (como repolho, couve-flor e couve-galega) são as plantas hospedeiras recomendadas. Brassica rapa (como alface chinesa e nabo) também pode ser utilizada. A espécie hospedeira selecionada deve ser registrada para garantir a rastreabilidade e permitir comparações futuras.

C)

Prepare diluições precisas do composto de teste a partir do produto comercial identificado. Para estudos iniciais, recomenda-se utilizar seis doses ou concentrações amplamente espaçadas, de forma a permitir a caracterização adequada da resposta dos insetos ao produto.  A adição de agente umectante é recomendada apenas quando o material foliar apresentar superfície altamente cerosa. Nesses casos, o mesmo agente umectante e na mesma concentração deve ser incluído também no tratamento controle, em substituição ao uso exclusivo de água. Como a presença de um umectante pode alterar o desempenho de um inseticida no bioensaio, sua identidade e concentração devem ser registradas juntamente com os resultados. Para avaliações de suscetibilidade, devem ser comparados apenas dados obtidos utilizando o mesmo agente umectante e a mesma concentração.

D)

Mergulhe as folhas individualmente no líquido de teste por 10 segundos, agitando suavemente, e coloque-as para secar na superfície sobre papel toalha (com a face abaxial voltada para cima). Certifique-se de que toda a superfície da folha esteja emersa uniformemente e não deixe que as folhas murchem. Mergulhe o mesmo número de folhas por tratamento (recomenda-se um mínimo de quatro folhas replicadas por concentração), e trate o material foliar suficiente para evitar o estresse por falta de nutrientes no grupo “testemunha” durante o teste. Comece mergulhando a amostra “não tratada” e vá progredindo até as diluições de teste (da mais baixa dose para a mais alta).

E)

Coloque as folhas tratadas e secas na superfície nos recipientes de teste etiquetados, que devem ser adequados para armazenar material foliar suficiente e em boas condições por até 96 horas.

Opcional: Um papel de filtro pode ser colocado dentro da base do recipiente para absorver qualquer excesso de condensação.

F)

Adicione números iguais de larvas L2 a cada recipiente, de forma que um total mínimo de 40 larvas seja utilizado por tratamento, dividido entre pelo menos quatro recipientes replicados. Feche os recipientes com a tampa.

Visto que o tempo de desenvolvimento pode variar entre populações de Plutella xylostella, a seguinte medida de comprimento pode ser usada para classificar larvas L2/L3:

3-5mm.

G)

Guarde os recipientes em um local onde não fiquem expostos à luz solar direta ou a temperaturas extremas. Registre as temperaturas máximas e mínimas. Se possível, é preferível uma temperatura média de 25°C, 60% de umidade relativa e um regime de luz/escuridão de 16:8.

H)

No caso dos inseticidas diamidas, a avaliação final da mortalidade larval (mortas e vivas) é feita após 96 horas. Para outros inseticidas, consulte as orientações fornecidas no início deste documento. Larvas que não conseguem realizar movimentos coordenados para se afastarem de um estímulo suave, como um alfinete ou uma pinça de ponta fina, em direção ao segmento posterior do corpo, devem ser consideradas mortas (uma combinação de mortas e gravemente afetadas). Os efeitos antialimentares (porcentagem de danos na folha ou crescimento larval) também podem ser registrados para informação adicional.

I)

Expresse os resultados como porcentagem de mortalidade corrigida (fórmula de Abbott). A mortalidade da testemunha deve ser registrada. Recomenda-se que os dados de mortalidade sejam utilizados para realizar uma análise de resposta à dose probit ou logit, a fim de fornecer estimativas de DL50 e DL90 para cada inseticida ou população de insetos testada.